Primer estudio de paleoproteoma de otolitos de peces fósiles y la preservación prístina del cristal biomineral huésped

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 3822 (2023) Citar este artículo

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Los otolitos son componentes de carbonato de calcio del órgano estatoacústico responsable de la audición y el mantenimiento del equilibrio corporal en los peces teleósteos. Durante su formación, el control sobre, por ejemplo, la morfología y el polimorfo de carbonato está influenciado por proteínas complejas similares al colágeno insolubles y conjuntos de proteínas solubles no colagenosas; Muchas de estas proteínas están incorporadas en su estructura cristalina de aragonito. Sin embargo, en el registro fósil estas proteínas se consideran perdidas a través de procesos diagenéticos, lo que dificulta los estudios de los mecanismos de biomineralización pasados. Aquí informamos la presencia de 11 proteínas específicas de peces (y varias isoformas) en otolitos de merluza fícida del Mioceno (ca. 14,8-14,6 Ma). Estos otolitos fósiles se conservaron en arcillas impermeables al agua y exhiben características microscópicas y cristalográficas indistinguibles de los representantes modernos, consistentes con un estado de conservación excepcionalmente prístino. De hecho, estos otolitos fósiles conservan ca. El 10 % de las proteínas secuenciadas a partir de sus homólogos modernos, incluidas proteínas específicas del desarrollo del oído interno, como proteínas similares a la otolina-1 implicadas en la disposición de los otolitos en el epitelio sensorial y proteínas similares a la otogelina/otogelina que se encuentran en el tejido acelular. Membranas del oído interno en peces modernos. La especificidad de estas proteínas excluye la posibilidad de contaminación externa. La identificación de una fracción de proteínas idénticas en otolitos de merluza de fícidos modernos y fósiles implica un proceso de biomineralización del oído interno altamente conservado a lo largo del tiempo.

La paleoproteómica es un campo de investigación en aceleración que proporciona nuevas perspectivas sobre, por ejemplo, la evolución de los procesos de biomineralización a través del tiempo y perfecciona nuestra comprensión de los restos fósiles1. Si bien los estudios del ADN antiguo se limitan a unos pocos millones de años porque el ADN se degrada relativamente rápido después de la muerte celular2, el estudio de restos de proteínas más estables en el registro fósil ofrece una oportunidad para explorar la función de las proteínas y su evolución en escalas de tiempo geológico; varios a cientos de millones de años3. Los estudios paleoproteómicos de biominerales como huesos, dientes y caparazones son particularmente prometedores porque dichas estructuras tienen un alto potencial para preservar residuos de proteínas incrustados en especímenes fósiles bien conservados. Aquí exploramos este potencial en estructuras fosilizadas de carbonato de calcio del oído interno de peces teleósteos (otolitos). Los otolitos de peces, a diferencia de los restos osteológicos de peces, se encuentran con frecuencia en el registro fósil durante el Mesozoico, y con creciente abundancia en los estratos del Cenozoico4. Debido a su morfología específica de taxón, estos fósiles son clave para la interpretación de la paleobiodiversidad de los peces y para las reconstrucciones paleoambientales basadas en sus composiciones de isótopos y oligoelementos5. Aunque las estructuras minerales de carbonato de calcio de los otolitos pueden parecerse a agregados de cristales precipitados inorgánicamente, en realidad son compuestos orgánicos-minerales complejos, similares a muchos otros carbonatos biogénicos6. Los estudios del proceso moderno de biomineralización de otolitos han demostrado que las macromoléculas orgánicas, en particular las proteínas, controlan aspectos clave de la formación de otolitos7, incluida la regulación del transporte de calcio, la nucleación y el estado de saturación en el sitio de cristalización, modulando así activamente el crecimiento de los cristales de aragonito8. De hecho, también se ha demostrado que la selección estricta de un polimorfo de carbonato de calcio específico (aragonito en lugar de, por ejemplo, calcita o vaterita) está controlada por proteínas, como el ácido aspártico y los residuos de serina, que atraen cationes de calcio a la superficie del cristal en crecimiento. y favorecen un empaquetamiento de iones más denso (es decir, aragonítico)9. Hasta la fecha, se han identificado varios cientos de proteínas en otolitos de peces modernos, muchas de las cuales se cree que están directamente involucradas en la biomineralización10. Las proteínas que se sabe que están involucradas en la biomineralización de los otolitos se pueden dividir en dos grupos principales: (1) complejos de proteínas estructurales insolubles similares al colágeno y (2) proteínas solubles no colagenosas (NCP). Las proteínas similares al colágeno, como la otolina-1, crean un andamio para el biomineral en crecimiento; La otolina-1 tiene homología de secuencias con el colágeno X, una proteína que también participa en la osificación endocondral y la reparación de fracturas óseas11. Las NCP solubles suelen ser proteínas altamente ácidas e intrínsecamente desordenadas (IDP) que regulan directamente la nucleación, la orientación y el crecimiento de los cristales. Estos desplazados internos se identificaron en varios taxones de peces, por ejemplo, Starmaker (Stm) en el pez cebra7, Starmaker-like (Stm-l) en medaka12 y Otolith Matrix Macromolecule-64 (OMM-64) en la trucha arco iris13, y su papel en la biomineralización. ha sido completamente caracterizado14,15,16,17.

Encontrar evidencia de proteínas incrustadas en otolitos fósiles mejoraría nuestra comprensión de la evolución de un importante proceso de biomineralización acuática, pero tales residuos aún no han sido identificados y en general se piensa que estos componentes orgánicos se descomponen y se pierden debido a la alteración diagenética del polimorfo de aragonita, que es metaestable y normalmente se transforma en una calcita más estable, por ejemplo, mediante procesos de disolución-precipitación en presencia de soluciones activas18. Estos procesos diagenéticos también afectan fuertemente la preservación de muchas proteínas inter/intracristalinas, en particular las NCP altamente lábiles19. Para tener éxito en la detección e identificación de restos de tales proteínas en otolitos fósiles, planteamos la hipótesis de que sólo los especímenes preservados en depósitos impermeables al agua y aún compuestos enteramente de aragonito con características ultraestructurales similares a sus homólogos modernos, tienen el potencial de preservar componentes orgánicos. , muy probablemente como inclusiones incrustadas dentro de los cristales de aragonita. Algunos fósiles de otolitos sagitales del Mioceno de peces teleósteos fáciles de encontrar cumplen estos criterios. Aquí informamos los resultados de una búsqueda de proteínas incrustadas en otolitos fósiles de merluza fícida encontradas en arcillas impermeables al agua del Mioceno (alrededor de 14 millones de años) expuestas en Korytnica (Montañas de la Santa Cruz, Polonia Central; ver Material)20.

Otolitos sagitales modernos (blancos) y fósiles (color pardusco) de Phycis spp. son estructuras biominerales de carbonato de calcio delgadas y alargadas; más ancho en la parte anterior y estrechándose gradualmente hacia las partes posteriores (Fig. 1a, h). La cara interna (superficie proximal) es convexa sin un surco acústico distintivo (el área donde el tejido sensorial entra en contacto con el otolito). La cara exterior (superficie distal) suele estar compuesta por engrosamientos/protuberancias y surcos irregulares (Fig. 1a, h). Las secciones delgadas longitudinales (es decir, en el plano sagital) observadas con luz transmitida normal y polarizada exhiben ca. Unidades columnares de 500 µm de espesor que corresponden en tamaño a protuberancias en la superficie (Fig. 1c, j). Ocasionalmente, se producen vacíos en forma de huso entre unidades columnares que pueden corresponder a los surcos entre protuberancias superficiales vecinas (flechas blancas en la Fig. 1c, j). Las unidades columnares y otras partes (proximales) de los otolitos fósiles y modernos en secciones longitudinales muestran numerosas capas (alternando zonas de color marrón oscuro e incoloras, de aproximadamente 5 a 7 µm de espesor; Fig. 1c,d,j,k. Las capas están compuestas de cristales que en imágenes de orientación cristalográfica (EBSD) están presentes con tamaño similar en muestras modernas y fósiles (Fig. 1e, l). Los mapas de fase han confirmado la mineralogía estrictamente aragonítica de muestras modernas y fósiles (Fig. 1f, m) y Las figuras polares resultantes son totalmente comparables entre los especímenes modernos (Fig. 1g) y fósiles (Fig. 1n). También se observó un alto grado de similitud entre los especímenes modernos y fósiles en cuanto al tamaño de los cristales, la inclinación, la dispersión azimutal y la distribución turboestrática en el plano (222) (Fig. 1g,n). Las fibras de aragonito de los otolitos fósiles y modernos consisten en unidades delgadas de aproximadamente 200 a 300 nm de ancho que muestran una organización nanogranular (Fig. 2a,b,g,h), con nanogranos ca. .50–100 nm de diámetro claramente visibles en imágenes en modo de error de altura y fuerza máxima del AFM (Fig. 2c,d,i,j). Las observaciones TEM de laminillas esqueléticas (extraídas mediante un haz de iones enfocado) muestran fibras de aragonita de escala fina comparables en tamaño a las observadas en FESEM cortadas oblicuamente (Fig. 2e) o longitudinalmente (Fig. 2k) con respecto a la dirección de crecimiento. Las fibras incluyen numerosos defectos intracristalinos de baja densidad (inclusiones) que varían en tamaño entre 2 y 25 nm, que se ven claramente como puntos brillantes en las imágenes TEM (flechas blancas en la Fig. 2f, l). Estas inclusiones están alineadas perpendicularmente con la dirección de crecimiento del cristal como se ve en los cortes longitudinales (Fig. 2f, l). En los límites de los granos también se encuentra material de baja densidad similar (Fig. 2e, k). Las muestras modernas y fósiles muestran perfiles de pérdida de peso similares en general, pero las curvas derivadas sugieren diferencias en la descomposición. Los otolitos modernos se descomponen en un rango de temperatura más amplio en comparación con los modernos (aprox. 200–430 °C frente a 250–400 °C) y muestran varios pasos de pérdida de peso (a aproximadamente 210 °C, 360 °C y 410 °C). C) en comparación con la única pérdida de peso relativamente grande (a aproximadamente 340 °C) en los otolitos fósiles (Figura complementaria S1).

Similitud morfológica, microestructural y cristalográfica de los otolitos sagitales modernos de Phycis phycis (a – g) y fósiles de Phycis tenuis (h – n). Las sagitarias modernas (a) y fósiles (h) son delgadas y alargadas; la cara exterior (superficie distal) más comúnmente está compuesta de engrosamientos/protuberancias y surcos irregulares. Las secciones delgadas en luz transmitida polarizada (b,c,i,j) y normal (d,k) muestran numerosos anillos de crecimiento y apuntan a la continuidad ontogenética de las protuberancias (columnas en corte longitudinal; ocasionalmente separadas por huecos en forma de huso, flechas blancas ). Las imágenes de orientación cristalográfica (EBSD) muestran cristales de aragonito de tamaño similar en muestras modernas (e) y fósiles (l) (los mapas de fases (f,m) confirman la mineralogía de aragonito de ambas muestras); Las cifras de los polos son totalmente comparables entre muestras modernas (g) y fósiles (n): mismo tamaño de cristal, distribución, inclinación, dispersión azimutal y distribución turboestrática en el plano (222). ZPAL P.21/R-OTH-242/001 (a–g); ZPAL P.21/ C-OTH-07/006 (h–n). Para crear las imágenes de orientación y las figuras de los polos se utilizó la paleta BungeColorKey (más accesible para usuarios daltónicos) de MTEX.

Estructura orgánica-mineral compuesta de otolitos sagitales de Phycis phycis (a – f) y fósiles de Phycis tenuis (g – l). En FESEM, las fibras de aragonito de los otolitos fósiles y modernos consisten en unidades delgadas de ca. 200–300 nm de ancho (a,g) que a mayor aumento (b,h) muestran organización nanogranular; nanogranos ca. De 50 a 100 nm de diámetro son visibles en las imágenes del modo de altura AFM (c, i) y del modo de error de fuerza máxima (d, j). Las observaciones TEM de laminillas esqueléticas (extraídas mediante un haz de iones enfocado) muestran fibras de aragonita de escala fina (comparables en tamaño con las observadas en FESEM) que incluyen numerosas inclusiones orgánicas (flechas en f,l). Las fibras en (e) se cortan de forma oblicua o longitudinal (k) con respecto a la dirección de crecimiento. ZPAL P.21/R-OTH-187/002 (a–f); ZPAL P.21/C-OTH-07/007 (g–l).

La racemización de aminoácidos y su contenido relativo en muestras de otolitos fósiles se utilizó como indicador de la degradación de proteínas. Los análisis se realizaron utilizando otolitos fósiles de P. tenuis comparados directamente con los modernos P. phycis. Las mediciones incluyeron aminoácidos libres originalmente presentes en biominerales (FAA), así como aquellos formados durante la hidrólisis de péptidos completos en aminoácidos individuales (los llamados aminoácidos hidrolizables totales, THAA). Los FAA tienden a resultar de la hidrólisis de aminoácidos N-terminales altamente racemizados, de modo que la relación D/L de FAA debería ser mayor que la de THAA para un aminoácido determinado. Como se esperaba, la distribución de aminoácidos entre grupos de aminoácidos libres (FAA) versus aminoácidos polimerizados (THAA-FAA; como pmol de aminoácidos por mg de otolito inicial) muestra que la mayoría de los aminoácidos en especímenes modernos son parte de péptidos intactos, mientras que la mayoría de los péptidos fósiles se han descompuesto en aminoácidos individuales. En especímenes fósiles se observó una pérdida dramática tanto de Asx como de Glx, que incluyen los aminoácidos ácidos aspártico y ácido glutámico, así como de Ser (Tabla 1).

En total, se detectaron péptidos para 132 proteínas específicas de peces y varias isoformas en otolitos modernos de P. phycis (Tabla complementaria S2), mientras que se encontraron péptidos para 11 proteínas específicas de peces en otolitos fósiles de P. tenuis (Tabla 2, Tablas complementarias S3 –S5), que es una tasa de retorno comparable a la de los esqueletos de coral (aragonito) modernos versus fósiles 21,22. Se observaron proteínas en ambas fracciones de solubilidad ácida en todas las muestras y GluC mejoró la detección de proteínas en muestras modernas, pero solo se detectaron péptidos de digestión tríptica en muestras fósiles (Tabla complementaria S6). Además, se detectó desamidación de asparagina y glutamina y oxidación de metionina (Tabla complementaria S6)23. Cinco de las 11 proteínas secuenciadas de otolitos fósiles representan proteínas codificadas por genes expresados en el oído interno (es decir, alfa-tectorina, beta-tectorina, similar a otolina-1, similar a otogelina/otogelina y similar a otogelina). Las otras seis proteínas se encuentran en los otolitos de los peces modernos, pero no son específicas de la función del oído interno. Las proteínas que se encuentran en los otolitos modernos, pero no en los fósiles, incluyen, por ejemplo, la usherina, una proteína importante para el desarrollo y la homeostasis del oído interno. Otras proteínas de otolitos modernos incluyen varios tipos de colágenos, contactina, lipoproteína relacionada con el receptor de baja densidad, anhidrasa carbónica que interconvierte CO2 y bicarbonato (Tabla complementaria S2).

Una de las características más distintivas de los biominerales, incluidos los carbonatos, es que son invariablemente compuestos orgánico-minerales en los que los componentes orgánicos, como polisacáridos, lípidos y proteínas, se incorporan o incrustan en la fase mineral inorgánica, formando niveles de meso a nanoescala. inclusiones y redes intra e intercristalinas 24,25. Estos componentes orgánicos participan en el proceso fisiológicamente mediado de formación de biominerales. Debido a que los perfiles proteómicos pueden vincularse con recursos/expresión transcriptómica, los estudios del proteoma de las estructuras biominerales modernas proporcionan información sobre los mecanismos moleculares de la biomineralización. Por lo tanto, la identificación de proteínas en estructuras biominerales fósiles genera esperanzas de obtener acceso indirecto a información relacionada con el genoma en ausencia de ADN conservado en fósiles mucho más antiguos que ca. 2 Dios, la edad más allá de la cual el ADN generalmente ya no sobrevive en el registro fósil 26,27.

Cada vez más, se han extraído datos paleoproteómicos de diversas estructuras biominerales fósiles 21,28,29,30,31. Sin embargo, hasta la fecha no existe información paleoproteómica de otolitos fósiles que representan los restos de peces más abundantes en los depósitos mesozoicos y cenozoicos. Este estudio es el primer informe sobre la identificación de proteínas en otolitos fósiles realizado en comparación directa con el proteoma de otolitos modernos congenéricos (merluzas fícidas). La siguiente discusión se centra en dos aspectos clave: criterios estructurales de biominerales fósiles que preservan información paleoproteómica prístina y análisis comparativo del contenido de proteínas en otolitos de merluza fícidas fósiles y modernos.

El material fósil seleccionado para este estudio provino de Korytnica, una localidad muy conocida por la preservación excepcional de biominerales aragoníticos (ver también la sección “Material”)32,33. De hecho, en todas las muestras de otolitos fósiles estudiadas aquí, sólo se detectó el polimorfo carbonato de aragonito; es decir, no observamos evidencia de la presencia de calcita secundaria u otras fases secundarias. La preservación excepcional de estos otolitos fósiles se ve respaldada además por sus características cristalográficas y ultraestructurales, que son indistinguibles de las que caracterizan a sus homólogos modernos en términos de distribución de tamaños de cristales, orientación/inclinación, dispersión azimutal y distribución turboestrática (plano (222) (Figs. 1, 2). Otra evidencia del estado de conservación extremadamente prístino de estos otolitos fósiles la proporciona la aparición de su textura nanogranular, típica de los otolitos y de la mayoría de los otros minerales biogénicos6,34,35. nm de diámetro), que normalmente se visualizan con microscopía de fuerza atómica (Fig. 2c,d,i,j) se consideran el producto de un proceso de biomineralización que involucra precursores amorfos 36, 37. En este proceso, las moléculas orgánicas se incorporan a la biomineral cristalizante, por ejemplo, como inclusiones y como 'envolturas' ricas en materia orgánica alrededor de los nanogranos resultantes (Fig. 2e, f, k, l) 25. Las proteínas individuales involucradas en el proceso de biomineralización de carbonatos tienen masas de hasta cientos de kDa y tamaños de de pocos a varios nanómetros de diámetro/radio de bobina aleatoria (proteínas estructuradas/IDP). Su incrustación en la estructura cristalina se interpretó como la aparición de inclusiones intra e intercristalinas38,39. Tales inclusiones están constantemente presentes en las muestras de otolitos fósiles y modernos analizadas en este estudio, y asumimos que son la fuente principal del material proteico en este estudio. Análisis (paleo)proteómicos previos examinaron la racemización de aminoácidos y sus mediciones de contenido relativo para evaluar el potencial de conservación de las muestras40. La degradación de proteínas se sugiere claramente por la distribución de aminoácidos entre grupos de aminoácidos libres (FAA) versus aminoácidos polimerizados (THAA-FAA, como pmol de aminoácidos por mg de material de otolito inicial); la mayoría de los péptidos fósiles se han descompuesto en aminoácidos individuales. El sesgo observado hacia los aminoácidos ácidos en especímenes fósiles sugiere que las proteínas altamente ácidas (comunes a los biominerales en general) son parte de porciones más solubles del biomineral, que fueron preferentemente degradadas; esto se refleja en los tipos de proteínas que se secuenciaron mediante LC-MS/MS (Tabla 2). La degradación de proteínas también está respaldada por los datos termogravimétricos. Los termogramas de muestras recientes muestran un rango de descomposición térmica más amplio y un mayor número de pasos de pérdida de peso en comparación con los fósiles. Las últimas muestras contienen compuestos orgánicos que difieren en su susceptibilidad a la descomposición térmica, por lo que no es sorprendente que el rango de temperatura de su descomposición sea relativamente amplio. Por lo tanto, parece que los otolitos modernos contienen una mayor diversidad de componentes orgánicos (proteínicos), lo que se manifiesta por un mayor rango de descomposición térmica (número de pasos de pérdida de peso) en comparación con los otolitos fósiles, para los cuales la diversidad orgánica es menor.

Se identificaron más de 130 proteínas en otolitos de Phycis phycis adulto moderno. Estos incluyen otolinas, otogelinas, usherinas y una cochlina, que han sido identificadas previamente en otolitos41,42. De las proteínas de otolitos modernos detectadas, 11 también se observaron en los otolitos fósiles de P. tenuis. Estos incluyen alfa y beta tectorina, dos proteínas similares a otogelina, similar a otolina-1 y una neuroserpina, todas las cuales se ha sugerido que están directamente involucradas en la biomineralización del carbonato de calcio. También identificamos en los otolitos fósiles proteínas adicionales que no se habían detallado previamente en los otolitos de peces, como la colagenasa; proteína inductora del factor de crecimiento transformante b, factor de empalme; proteína tipo 19 rica en arginina/serina; proteínas similares a protocadherina FAT 4; y trombospondina. Todas estas proteínas adicionales, excepto el factor de empalme, tienen términos GO que las designan como extracelulares o asociadas con una membrana. Varios se unen al calcio y al menos uno, la protocadherina, se ha detectado en carbonatos biogénicos de otros organismos43.

Hay varias razones posibles por las que este conjunto particular de proteínas previamente establecidas como proteínas de la matriz de otolitos se conservaron en los otolitos fósiles estudiados aquí. La co-conservación de algunas proteínas puede resultar de sus interacciones íntimas durante la biomineralización. Tanto la otogelina como las alfa tectorinas son necesarias para unir la membrana del otolito a las estructuras sensoriales del oído44, y la otogelina es crucial en el desarrollo larvario temprano de la siembra inicial del otolito10. Las beta tectorinas probablemente secuestran calcio a medida que avanza la biomineralización10 y pueden polimerizarse con otolina45, posiblemente mejorando su co-conservación. De manera similar, las alfa tectorinas poseen un dominio Nidogen N-terminal que se ha propuesto para permitirle interactuar también con la otolina46. Las proteínas detectadas en otolitos fósiles son algunas de las proteínas con mayor puntuación en los otolitos modernos (las puntuaciones más altas indican una coincidencia más segura entre las puntuaciones combinadas de todos los espectros de masas observados y las secuencias de aminoácidos dentro de la proteína examinada), lo que se ha demostrado que está relacionado linealmente con abundancia relativa de proteínas47. Por último, algunas proteínas con residuos ácidos que proporcionan un andamio orgánico para la formación de biominerales (p. ej., tipo otolina-148) están fuertemente estabilizadas por iones de calcio; dichas proteínas pueden adherirse firmemente a la superficie biomineral, lo que puede mejorar su potencial de conservación en el registro fósil29.

Nuestras observaciones refinan los criterios estructurales para la preservación excepcional de los biominerales carbonatados en el registro fósil, y las secuencias de paleoproteínas indican procesos de biomineralización del oído interno altamente conservados en los peces a lo largo del tiempo geológico.

Se recolectaron otolitos modernos de Forkbeard (Phycis phycis, familia Phycidae) de peces capturados por pescadores a lo largo de la costa occidental portuguesa continental entre 2011 y 2012. Los otolitos sagitales se extrajeron con una sección ventral del cráneo a través de las branquias, se enjuagaron con agua, se secaron al aire y se almacenaron en recipientes etiquetados. tubos de plástico en la Facultad de Ciencias de Lisboa (Portugal) hasta el análisis49,50. Se seleccionaron dos ejemplares grandes de Phycis phycis para análisis de estructura biomineral (ZPAL P.21/R-OTH-242/001, ZPAL P.21/R-OTH-187/002) y tres ejemplares (aprox. 2,5 g de peso) fueron seleccionados para el análisis de proteoma (ZPAL P.21/R-OTH-196/003, ZPAL P.21/R-OTH-197/004, ZPAL P.21/R-OTH-198/005).

Las muestras de otolitos sagitales fósiles de P. tenuis se recolectaron de las arcillas de Korytnica [posición GPS: 50°39′50′′ a 50°40′50′′ N y 20°31′20′′ a 20°33′00′ ′ mi; tres sitios: Korytnica-Plebania, Korytnica-Forest y Mt. Lysa33], una facies única depositada en la parte terminal de la bahía (Cuenca de Korytnica) desarrollada en el Mioceno a lo largo de la costa rocosa en la vertiente sur de las Montañas de la Santa Cruz, Polonia Central20. La cuenca de Korytnica está llena de una secuencia sedimentaria poco profunda compuesta de ca. Secuencia de arcillas de 30 a 60 m de espesor, que se entrelazan localmente con criaderos de conchas de ostras. La edad absoluta de la secuencia de Korytnica se estima en 14,8–14,6 Ma51,52 Las arcillas de Korytnica son conocidas por la preservación prístina de fósiles del Mioceno. Esta preservación excepcional está respaldada por la mineralogía de la aragonita (un polimorfo de CaCO3 metaestable en condiciones normales) de esqueletos de, por ejemplo, corales escleractinios, gasterópodos y otolitos de peces y sus características micro y nanoestructurales distintas y totalmente comparables a sus homólogos modernos6. Las condiciones inusualmente favorables de la fosilización se ven respaldadas además por patrones de color residuales excepcionales de algunas conchas de gasterópodos y percebes20,53,54. Tal preservación implica que los fósiles incrustados en arcillas impermeables estaban prácticamente aislados del entorno extremo. Después de la retirada de los mares de Paratethys de las afueras del sur de las Montañas de la Santa Cruz, estos sedimentos no quedaron cubiertos por una gruesa capa sedimentaria adicional que podría causar cualquier efecto de calor de gradiente geotérmico en el material fósil. La temperatura media anual preestablecida para la región de Świętokrzyskie en Polonia oscila entre 5,61 °C (en 1940) y 10,10 °C (en 2019); observaciones desde 1901 hasta 202155. Teniendo en cuenta la naturaleza de grano muy fino de las arcillas de Korytnica y, en consecuencia, la conductividad térmica extremadamente baja, típica de tales sedimentos56, puede ser confiable sugerir que las muestras de otolitos examinadas (recuperadas de sedimentos encontrados hoy a 1-2 m de profundidad ) no han experimentado fluctuaciones significativas de temperatura durante su historia de entierro.

Las muestras de arcilla se lavaron y tamizaron a través de tamices estándar (500/250/125 μm) y se secaron a 40 °C. De ca. Se seleccionaron 300 ejemplares de otolitos de P. tenuis, 2 ejemplares fueron seleccionados para análisis de estructura biomineral (ZPAL P.21/C-OTH-07/006, y ZPAL P.21/C-OTH-07/006); Se seleccionaron 20 muestras (aproximadamente 1,6 g de peso) para el análisis del proteoma (número colectivo ZPAL P.21/C-OTH-07/008-027). Las muestras seleccionadas para los análisis de (paleo)proteoma se empaparon en hipoclorito de sodio (5%) durante 3 h, se enjuagaron y se sometieron a ultrasonidos con agua desionizada y se secaron a 40 °C durante la noche.

El material de otolitos modernos y fósiles se encuentra en el Instituto de Paleobiología de la Academia Polaca de Ciencias de Varsovia (abreviatura ZPAL). La información detallada de identificación de la muestra se proporciona en la Tabla complementaria S1.

Las características estructurales del otolito se estudiaron y fotografiaron utilizando un microscopio de luz transmitida Nikon Eclipse 80i en el Instituto de Paleobiología de la Academia Polaca de Ciencias, Microscopía Electrónica de Barrido por Emisión de Campo (FESEM, Zeiss Merlin) en el Departamento de Química de la Universidad de Varsovia, Termo Microscopio Fisher Tecnai Osiris en las instalaciones centrales de microscopía electrónica (CIME) del Instituto Federal Suizo de Tecnología en Lausana (EPFL), y microscopía de fuerza atómica (AFM) utilizando un instrumento multimodo 5 (Veeco) actualizado a la versión multimodo 8 (Bruker), en el Departamento de Química, Universidad de Varsovia. Se tomaron imágenes de microscopio óptico (en luz polarizada) de secciones ultrafinas (de 2 a 12 μm de espesor) realizadas en el plano sagital del otolito. Se tomaron imágenes FE-SEM de secciones transversales rotas de otolitos montados en trozos con cinta adhesiva de doble cara y recubiertos con una película conductora de platino; el voltaje de aceleración fue de 5 kV, la distancia de trabajo de 4 a 6 mm. Las imágenes de microscopía de fuerza atómica se adquirieron en modo ScanAsyst utilizando voladizos de silicona dedicados. Se recogieron simultáneamente dos señales (altura y error de fuerza máxima) durante cada exploración. Se enjuagaron secciones sagitales pulidas con otolitos (suspensión de pulido final Buehler Topol 3 con un tamaño de partícula de 0,25 µm) en agua Milli-Q, se lavaron en un limpiador ultrasónico durante 10 s y luego se grabaron con una solución de agua Milli-Q durante 7 h. Las imágenes fueron procesadas con el software WSxM v5.0 Develop 10.2 de Nanotec57. Las muestras para microscopía electrónica de transmisión (TEM) se prepararon como láminas de TEM transversales extraídas y luego molidas usando una máquina de haz de iones enfocados Gemini NVision 40 de doble haz. Los trozos iniciales se muelen con iones de galio a 30 kV, 6,5 nA y luego se adelgazan con corrientes más bajas paso a paso hasta usar 80 pA, y finalmente se alisan a 5 kV, 80 pA. Los análisis TEM se realizaron con un voltaje de aceleración de 200 kV. Se registraron imágenes de campo oscuro anular de alto ángulo (HAADF) en modo de microscopía electrónica de transmisión de barrido (STEM) con un tamaño de punto de 0,5 nm y una longitud de cámara de 115 mm.

La muestra de superficie (de portaobjetos gruesos) se pulió con alúmina de 1 µm, 0,3 µm y 0,05 µm y finalmente se pulió con sílice coloidal (0,05 µm). Antes del análisis, las muestras se recubrieron con una fina capa (aproximadamente 2 nm) de carbono utilizando un recubridor de alto vacío. El estudio EBSD se llevó a cabo con el detector Oxford NordlysMax montado en un microscopio electrónico de barrido JEOL JSM-6610LV en el Instituto de Ingeniería de Materiales de la Universidad Tecnológica de Łódź. Los datos de EBSD se recopilaron con el software AztecHKL en alto vacío, 20 kV, corriente de sonda grande y 20 mm de distancia de trabajo. Los patrones de EBSD se recolectaron con una resolución de 0,22 μm de tamaño de paso para mapas cristalográficos utilizando la configuración de celda unitaria característica de aragonita y calcita de la siguiente manera58,59: simetría “Pmcn” y a = 4,96 Å, b = 7,97 Å y c = 5,75 Å estimado para el coral Favia utilizando difracción de rayos X en polvo con radiación sincrotrón (43) y a = b = 4,99 Å y c = 17,06 Å, respectivamente. Los datos de EBSD están representados en este estudio mediante mapas cristalográficos, imágenes de fase y figuras de polos, que representan la proyección estereográfica de planos cristalográficos en referencia a los planos de aragonito (100), (010), (001) y (222). Las imágenes de orientación y las figuras polares se crearon utilizando el complemento de código abierto MTEX para el programa Matlab (https://mtex-toolbox.github.io/). Para eliminar la combinación de colores rojo y verde y crear imágenes más accesibles para los usuarios daltónicos, seleccionamos la paleta BungeColorKey de MTEX (el resultado se probó usando Coblis, el simulador de daltonismo en https://www.color-blindness.com/coblis -simulador-de-daltonismo/).

El análisis termogravimétrico se realizó con un aparato TGA Q50 (TA Instruments) en el Departamento de Química de la Universidad de Varsovia. Las muestras de otolitos (37,48 y 37,16 mg para muestras fósiles y recientes, respectivamente) se calentaron en un ambiente de nitrógeno bajo un gradiente lineal (10 °C min-1) desde una temperatura ambiente de 20 °C a 550 °C.

La primera prueba de la suposición de que permanece material orgánico original en el otolito incluyó el análisis de racemización de aminoácidos (AAR)60,61. El análisis AAR proporcionó información de que las muestras se habían limpiado adecuadamente (D/L de especímenes fósiles acercándose a (1), que el material proteico original todavía estaba incrustado (D/L de especímenes fósiles acercándose a (1), y dio una idea del estado de degradación (es decir, concentraciones relativas y abundancias de aminoácidos similares a las de las muestras de otolitos modernos deberían sugerir una degradación mínima).

Los aminoácidos para el análisis de racemización, tanto libres como hidrolizables totales, se extrajeron, hidrolizaron y evaporaron hasta sequedad a partir de polvos de esqueleto limpios (descritos a continuación) mediante métodos estándar61. Todas las muestras se prepararon por duplicado y se analizaron en el Laboratorio de Geocronología de Aminoácidos de la Universidad del Norte de Arizona utilizando métodos estándar con modificaciones para microfósiles60,62. A las muestras rehidratadas se les añadió L-homo-arginina como estándar interno y luego se inyectaron en una HPLC equipada con una columna rellena de C18 de fase inversa. Se incluyeron muestras "en blanco". Anteriormente hemos demostrado que nuestro protocolo de configuración y manipulación de "espacios limpios" son suficientes para evitar la contaminación de proteínas exógenas en el laboratorio21.

Los otolitos fósiles y modernos se pulverizaron con mortero a 125 μm, se oxidaron en lejía concentrada 50:50/H2O2 durante 1 h mientras se sonicaban siguiendo los métodos modificados de Stoll et al.63, se enjuagaron cinco veces con MilliQ y se secaron. La oxidación y los enjuagues se repitieron dos veces más. Los polvos limpios de aproximadamente 0,5 g por muestra se descalcificaron en ácido acético 0,5 M y todo el manejo se realizó en una campana de flujo laminar para minimizar la contaminación. La matriz orgánica soluble (MOS) se concentró mediante filtración centrífuga (Amicon, límite de 3 kDa) y se enjuagó con solución salina tamponada con fosfato filtrada. La matriz orgánica insoluble (IOM; material que se granuló a 43.000 xg durante 5 min) se lavó tres veces con acetona al 80%. Las proteínas fósiles se prepararon como muestras individuales para cada fracción de solubilidad (muestra 07); Las muestras modernas se extrajeron como triplicados biológicos (muestras 196-198). Las muestras se solubilizaron en tampón SDS y luego se digirieron usando el protocolo MED-FASP en una unidad centrífuga Microcon de 30 kDa (Sigma Aldrich) después de enjuagar el tampón SDS con urea 64 8 M mediante aplicaciones secuenciales de tripsina y luego enzimas Glu-C. Las muestras se secuenciaron mediante espectrometría de masas en tándem con cromatografía líquida (LC-MS/MS) en las instalaciones de proteómica del Instituto Semel de UCLA. Cada fracción se analizó por separado en un sistema de cromatografía nanolíquida acoplado a un espectrómetro de masas orbitrap de alta resolución de mesa (QE-Plus; Thermo Fisher) y se operó en modo de iones positivos con adquisición dependiente de los datos. MS1 se realizó con una resolución de 70.000 (a 400 m/z) y MS2 con 17.500. Se realizaron blancos instrumentales entre todas las muestras para minimizar el arrastre. Los espectros de masas transformados se analizaron en Mascot con la base de datos UniProt-Human, una base de datos de contaminantes comunes y la base de datos de 65 proteínas predichas del genoma Phycis phycis. La base de datos de proteínas de P. phycis (Tabla complementaria S5) se generó utilizando el proceso BRAKER, que incluye el uso de los programas GeneMark-ES/ET y Augustus66,67,68,69, para predecir regiones codificantes de proteínas de P. genoma físico. Se utilizó la base de datos de proteínas predichas del bacalao del Atlántico (Gadus morhua) (conjunto NCBI GCA_902167405.1 gadMor3.0) (archivo de proteínas predichas disponible) para ingresar "pistas" para guiar la predicción de CDS. Todas las muestras permitieron una modificación fija de la carbamidometilación en C y una oxidación variable en MW, desamidación en NQ y acetilación N-terminal de proteína; También se permitieron muestras fósiles de Phospho K&T y MOD. Para cada muestra, se llevó a cabo una primera búsqueda de señuelos para determinar los valores de p para una tasa de descubrimiento falso del 1%. Luego se realizó una búsqueda tolerante a errores, ajustando el valor p si era necesario. Las puntuaciones de corte se aplicaron al valor recomendado por el algoritmo Mascot. Las secuencias devueltas se anotaron en el software Blast2GO y se ejecutaron posteriormente en Blast2GO contra la base de datos NCBI nr primates para detectar posibles contaminantes humanos no detectados por la base de datos UniProt-Human en Mascot; Las proteínas probablemente contaminantes humanas fueron excluidas de la lista final si eran > 90% similares a primates con un valor e dentro de 20 unidades de la anotación original, dentro de 10 unidades de valor e y 10% de similitud para e-50 e inferior, o dentro de 5 unidades de valor e y 10% de similitud para e-50 y superiores22. Se comprobaron secuencias duplicadas en CD-HIT con > 90% de similitud; los duplicados se anotan por separado pero se cuentan juntos en el recuento total de proteínas. Varias proteínas se predijeron como péptidos separados; esos péptidos se hicieron BLAST contra el proteoma predicho del bacalao del Atlántico (Gadus morhua) (ensamblaje NCBI GCA_902167405.1 gadMor3.0) y se concatenaron, con cadenas de XX que denotan regiones de secuencia desconocida entre péptidos conocidos.

Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo publicado (y su información complementaria). Los datos de proteómica de espectrometría de masas se han depositado en el Proteomic Xchange Consortium a través del repositorio de socios de Pride70 (https://www.ebi.ac.uk/pride/login) con el identificador de conjunto de datos PXD036742 y https://doi.org/10.6019. /PXD036742. No se requirió aprobación ni orientación ética porque este estudio solo analizó especímenes recolectados de desembarques comerciales de barcos pesqueros y material fósil en colecciones de museos.

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Este trabajo fue apoyado por las subvenciones de investigación del Centro Nacional de Ciencias (Polonia) 2017/25/B/ST10/02221 y 2020/39/B/ST10/01253 para JS, la beca de investigación posdoctoral en biología de la NSF n.º 1611943 y la beca de liderazgo posdoctoral STEM de Zuckerman. a JD, y la Fundación Nacional Suiza para la Ciencia subvenciona 205321_212614 a AM. ARV contó con el apoyo de la Fundação para a Ciência ea Tecnologia (FCT, Portugal) a través del contrato de investigación CEECIND/01528/2017. Agradecemos a T. Bernat, el Laboratorio de Geocronología de Aminoácidos de la Universidad del Norte de Arizona y el Laboratorio de Proteómica del Instituto NPI-Semel de UCLA por el procesamiento de muestras y el análisis de aminoácidos y proteínas, respectivamente.

Instituto de Paleobiología, Academia Polaca de Ciencias, Twarda 51/55, 00818, Varsovia, Polonia

Jarosław Stolarski

Departamento de Ciencias de la Tierra, Planetarias y Espaciales, Universidad de California, Los Ángeles, CA, EE. UU.

Jean Drake

Facultad de Ciencias Biológicas y Ambientales, Universidad de León, Campus de Vegazana S/N, 24171, León, España

Ismael Coronado

Departamento de Biología Animal, Facultad de Ciencias, Universidad de Lisboa, Campo Grande, 1749-016, Lisboa, Portugal

Ana R. Vieira

Centro de Ciencias Marinas y Ambientales (MARE), Universidad de Lisboa, Campo Grande, 1749-016, Lisboa, Portugal

Ana R. Vieira

Departamento de Geología, Universidad de Varsovia, Żwirki i Wigury 93, 02089, Varsovia, Polonia

Urszula Radwańska

Departamento de Biología Integrativa, Universidad Estatal de Michigan, East Lansing, MI, EE. UU.

Elizabeth AC Heath-Heckman

Departamento de Química, Universidad de Varsovia, Pasteura 1, 02-093, Varsovia, Polonia

Maciej Mazur

Escuela de Ciencia e Ingeniería de Materiales, Universidad de Hubei, Wuhan, 430062, Hubei, China

Jin Ming Guo

Laboratorio de Geoquímica Biológica, Escuela de Arquitectura, Ingeniería Civil y Ambiental, Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne, 1015, Lausanne, Suiza

Anders Meibom

Centro de Análisis Avanzado de Superficies, Instituto de Ciencias de la Tierra, Universidad de Lausana, 1015, Lausana, Suiza

Anders Meibom

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JS y JD diseñaron el estudio, analizaron los datos y redactaron el manuscrito. ARV y UR proporcionaron e identificaron material de otolitos modernos y algunos fósiles. IC realizó mapas de EBSD e interpretó mediciones cristalográficas. MM realizó imágenes AFM y análisis termogravimétricos. CADA uno realizó la predicción de la proteína P. phycis utilizando BRAKER. GJ hizo análisis TEM. JS, JD, IC, EACH, GJ, AM contribuyeron a la interpretación de los resultados y a la redacción del manuscrito.

Correspondencia a Jarosław Stolarski.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Stolarski, J., Drake, J., Coronado, I. et al. Primer estudio de paleoproteoma de otolitos de peces fósiles y la preservación prístina del cristal biomineral huésped. Informe científico 13, 3822 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-30537-8

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Recibido: 09 de noviembre de 2022

Aceptado: 24 de febrero de 2023

Publicado: 07 de marzo de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-30537-8

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